Identificación de proteínas por pegada peptídica (MS)
Identificación de proteínas por espectrometría de masas mediante pegada dactilar peptídica (PMF: Peptide Mass Fingerprinting), usando o espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF (Bruker).
A partir das bandas de xel, subministradas polo usuario, as proteínas son dixeridas inicialmente con tripsina (encima que rompe especificamente por lisinas e arxininas se están unidas a unha prolina). O dixerido peptídico deposítase nunha placa MALDI para a súa posterior análise. Obtense a relación m/z dos péptidos xerados na dixestión, o que determinará a pegada peptídica de esa/s proteína/s. Estas masas experimentais serán comparadas coas masas teóricas existentes nas bases de datos e a súa correlación dará lugar a unha óptima identificación.
Fragmentación MSMS por MALDI-TOF/TOF
Identificación de proteínas mediante os espectros de fragmentación dalgunhas das masas dos péptidos obtidos, usando o espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF (Bruker) e a súa correlación coas bases de datos existentes. A fragmentación dos péptidos pódese facer mediante a técnica LIFT (descomposición metaestable) ou mediante Collision-Induced Dissociation (fragmentación de alta enerxía).
Identificación de proteínas por nLC-MSMS
En mostras onde existe unha mestura de proteínas, previo análise por espectrometría de masas, realizarase unha separación nun sistema cromatográfico. En función das características da mostra hai dúas posibilidades:
- Nano-LC (Easy-nLC de Proxeon) acoplado a un espoteador de placas MALDI (Proteineer fc de Bruker), onde tras separar os péptidos trípticos por cromatografía de fase reversa, o resultado da cromatografía é espoteado, automaticamente, en distintas fraccións nunha placa MALDI, para a súa posterior análise de identificación por PMF e MSMS no espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF.
- Nano-LC (Easy-nLC de Proxeon) acoplado on-line ó amaZon ETD de Bruker, onde os péptidos trípticos inicialmente separados por cromatografía de fase reversa son directamente introducidos na trampa de ións para a súa análise. Os espectros de fragmentación serán posteriormente interpretados para a súa identificación.
Dixestións trípticas
As proteínas dixírense cunha encima, normalmente tripsina (proteasa que rompe especificamente nos residuos arxinina e lisina do lado carboxílico). Para posterior análise por espectrometría de masas dos péptidos obtidos.
Disponse dun kit da casa Millipore (In-Gel DigestZp kit) para dixerir proteínas resoltas vía electroforese 1D ou 2D.
- Control da dixestión:
- Dixestión dunha banda dun marcador de peso do propio xel.
- Control de contaminantes:
- Dixestión dun fondo do propio xel.
- Dixestión nunha cunca do kit baleiro, sen xel.
- Control de sensibilidade dos espectrómetros de masas:
- Identificación dun Standard de BSA de baixa concentración: 50 fmol.
- Control dos resultados:
- Os resultados das buscas analízanse de forma visual.
———
Considérase responsabilidade do laboratorio e, polo tanto, non serán facturados aos usuarios, aquelas análises nas que se obteña un resultado erróneo para os controis internos anteriormente descritos. Deixando claro que si os controis internos do laboratorio dan positivos e os do usuario dan negativos, os gastos corren a cargo do usuario.
O laboratorio recomenda sempre gardar unha alícuota da mostra que se manda a analizar.
As mostras entregaranse na Unidade de masas xunto coa solicitude debidamente cumplimentada. O laboratorio debe ademáis dispoñer dunha imaxe do xel do que proceden os spots a analizar.
- Almacenamento dos xeles: Os xeles poden conservarse húmidos durante algunhas semanas en ácido acético ao 1% a 4 ºC. As bandas recortadas do xel poden almacenarse conxeladas en auga ou ácido acético ao 1 %. Os xeles secos poden ser válidos, mesmo despois de varios anos de conservación, sempre que as súas superficies non foran contaminadas con pegadas ou po, nos que se atopan queratinas. Non obstante, é mellor traballar con xeles húmidos libres de recubrimentos de plástico ou celulosa.
- Tipos de xeles compatibles: Pode ser válido, nun principio, calquera tipo de xel de poliacrilamida. É fundamental que o grosor dos mesmos se atope entre 1 e 1.5 mm e que a porcentaxe de acrilamida (que se pode usar neste kit) sexa do 4-20 %. O tamaño da peza do xel sería de 1-3 mm de diámetro para xeles 1D e de 1-2 mm de diámetro para xeles 2D. Debe terse especial precaución en non introducir no xel substancias estrañas que poidan intervir na análise mediante espectrometría de masas. Neste eixe, para evitar a presencia de restos de acrilamida non polimerizada, é aconsellable prolongar a polimerización toda unha noite.
- Reactivos compatibles con espectrometría de masas tipo MALDI-TOF:
- Empregar reactivos co grao de pureza para HPLC e auga milli-Q.
- Compostos que non interfiren coa espectrometría de masas: Ácido Trifluoroacético, Ácido Fórmico, Beta-Mercaptoetanol, DTT, Solventes orgánicos volátiles, HCL, NH4OH, Ácido Acético.
- Compostos que nunha concentración menor a 50mM non interfiren coa espectrometría de masas: HEPES, MOPS, Tris, NH4O, Ácido Octyl glucosido.
- Evitar os seguintes compostos: Glicerol, azida sódica, DMSO, SDS, fosfatos, NaCL, 2M urea, 2M guanidina.
- Contaminación por queratinas: É esencial traballar coa maior limpeza posible, xa que a incorporación das proteínas contaminantes dificulta ou impide a identificación da proteína de interese. Os contaminantes máis frecuentes son a seroalbúmina bovina e as queratinas humanas, estas últimas abundan no po, as pegadas dactilares e o cabelo. Por esta razón haberá que poñer especial énfase na limpeza dos cristais que se empreguen na electroforeses e empregar solucións de tintura frescas. Nunca tocar o xel cos dedos, bisturís ou pinzas e calquera material, que se empregue para recortar as manchas, débese limpar.
- Cantidade da proteína: Canto maior sexa a cantidade da proteína presente na mancha máis sinxelo resultará identificala. As proteínas detectables por Coomasie soen dar espectros MALDI de moi boa calidade, pero unha porcentaxe moi elevada das tinguidas con prata poden tamén ser identificadas inequivocamente. Co kit de Millipore obtéñense bos resultados con 100 fmoles de proteína. Débese ter en conta que as proteínas de baixa masa molecular (< 20 Kda) poden resultar difíciles de identificar debido ao baixo número de péptidos que orixina a súa dixestión encimática. Para a identificación correcta das proteínas por Maldi-Tof requírese cas bandas das proteínas conteñan unha única proteína maioritaria.
- Métodos de tintura: Existen diversos métodos compatibles coa posterior dixestión tríptica e a análises mediante espectrometría de masas. Cando a cantidade de proteína é suficiente pode empregarse a tintura con Coomasie común ou con Coomasie coloidal, pero si se ve obrigado a recorrer á tintura con prata, empregar un método de tintura con prata compatible con espectrometría de masas que non sexa destrutiva (que non conteña glutaraldehido).
- Envío das mostras: As bandas das proteínas deberán recortarse do xel adaptándose estritamente ao contorno das mesmas co fin de non incrementar a proporción da acrilamida na mostra. As dimensións da banda non deben exceder de 1x3 mm para 1D y 1-2 mm de diámetro para bandas 2D, xa que tamaños maiores non se adecúan ao proceso da dixestión do kit. Para a escisión pódese empregar un bisturí e unhas pinzas ou unha punta desbotable convenientemente recortada, tendo sempre coidado de que este material se atope completamente limpo. As bandas así recortadas débense enviar en tubos eppendorf pequenos cubertos de auga milli-Q. Para calquera envío das mostras, contactar previamente antes co responsable da Unidade na extensión 16242 ou no e-mail: esteban.guitian [at] usc.es (esteban[dot]guitian[at]usc[dot]es).
Desalgado por ZIP-TIP
Proceso de desalgado e concentrado de péptidos e proteínas. Para facelo empréganse unhas puntas de pipeta que conteñen unha fase reversa ben C18 ou C4.