Identificación de proteínas por huella peptídica (MS)
Identificación de proteínas por espectrometría de masas mediante huella dactilar peptídica (PMF: Peptide Mass Fingerprinting), usando el espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF (Bruker).
A partir de las bandas de gel, suministradas por el usuario, las proteínas son digeridas inicialmente con tripsina (enzima que rompe específicamente por lisinas y argininas se están unidas a una prolina). El digerido peptídico se deposita en una placa MALDI para su posterior análisis. Se obtiene la relación m/z de los péptidos generados en la digestión, lo que determinará la huella peptídica de esa/s proteína/s. Estas masas experimentales serán comparadas con las masas teóricas existentes en las bases de datos y su correlación dará lugar la una óptima identificación.
Fragmentación MSMS por MALDI-TOF/TOF
Identificación de proteínas mediante los espectros de fragmentación de algunas de las masas de los péptidos obtenidos, usando el espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF (Bruker) y su correlación con las bases de datos existentes. La fragmentación de los péptidos se puede hacer mediante la técnica LIFT (descomposición metaestable) o mediante Collision-Induced Dissociation (fragmentación de alta energía).
Identificación de proteínas por nLC-MSMS
En muestras donde existe una mezcla de proteínas, previo análisis por espectrometría de masas, se realizará una separación en un sistema cromatográfico. En función de las características de la muestra hay dos posibilidades:
- Nano-LC (Easy-nLC de Proxeon) acoplado la un espoteador de placas MALDI (Proteineer fc de Bruker), donde tras separar los péptidos trípticos por cromatografía de fase reversa, el resultado de la cromatografía es espoteado, automáticamente, en distintas fracciones en una placa MALDI, para su posterior análisis de identificación por PMF y MSMS en el espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF.
- Nano-LC (Easy-nLC de Proxeon) acoplado on-line al amaZon ETD de Bruker, donde los péptidos trípticos inicialmente separados por cromatografía de fase reversa son directamente introducidos en la trampa de iones para su análisis. Los espectros de fragmentación serán posteriormente interpretados para su identificación.
Digestiones trípticas
Las proteínas se digieren con una enzima, normalmente tripsina (proteasa que rompe específicamente en los residuos arginina y lisina del lado carboxílico). Para posterior análisis por espectrometría de masas de los péptidos obtenidos.
Se disponen de un kit de la casa Millipore (In-Gel DigestZp kit) para digerir proteínas resueltas vía electroforesis 1D o 2D.
- Control de la digestión:
- Digestión de una banda de un marcador de peso del propio gel.
- Control de contaminantes:
- Digestión de un fondo del propio gel.
- Digestión en una taza del kit vacío, sin gel.
- Control de sensibilidad de los espectrómetros de masas:
- Identificación de un estándar de BSA de baja concentración: 50 fmol.
- Control de los resultados:
- Los resultados de las búsquedas se analizan de forma visual.
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Se considera responsabilidad del laboratorio y, por lo tanto, no serán facturados a los usuarios, aquellos análisis en los que se obtenga un resultado erróneo para los controles internos anteriormente descritos. Dejando claro que si los controles internos del laboratorio dan positivos y los del usuario dan negativos, los gastos corren a cargo del usuario.
El laboratorio recomienda siempre guardar una alícuota de la muestra que se manda a analizar.
Las muestras se entregarán en la Unidad de masas junto con la solicitud debidamente cubierta. El laboratorio debe además disponer de una imagen del gel del que proceden los spots a analizar.
- Almacenamiento de los geles: Los geles pueden conservarse húmedos durante algunas semanas en ácido acético al 1 % a 4 °C. Las bandas recortadas del gel pueden almacenarse congeladas en agua o ácido acético al 1 %. Los geles secos pueden ser válidos, incluso después de varios años de conservación, siempre que sus superficies no hayan sido contaminadas con huellas o polvo, en los que se encuentran queratinas. No obstante, es mejor trabajar con geles húmedos libres de recubrimientos de plástico o celulosa.
- Tipos de geles compatibles: Puede ser válido, en principio, cualquier tipo de gel de poliacrilamida. Es fundamental que el grosor de los mismos se encuentre entre 1 y 1.5 mm y que el porcentaje de acrilamida (que se puede usar en este kit) sea del 4-20 %. El tamaño de la pieza del gel sería de 1-3 mm de diámetro para geles 1D y de 1-2 mm de diámetro para geles 2D. Debe tenerse especial precaución en no introducir en el gel sustancias extrañas que puedan intervenir en el análisis mediante espectrometría de masas. Para evitar la presencia de restos de acrilamida no polimerizada es aconsejable prolongar la polimerización toda una noche.
- Reactivos compatibles con espectrometría de masas tipo MALDI-TOF:
- Emplear reactivos con el grado de pureza para HPLC y agua milli-Q.
- Compuestos que no interfieran con la espectrometría de masas: Ácido Trifluoroacético, Ácido Fórmico, Beta-Mercaptoetanol, DTT, Solventes orgánicos volátiles, HCL, NH4OH, Ácido Acético.
- Compuestos que en una concentración menor a 50mm no interfieren con la espectrometría de masas: HEPES, MOPS, Tris, NH4Lo, Ácido Octyl glucosido.
- Evitar los siguientes compuestos: Glicerol, azida sódica, DMSO, SDS, fosfatos, NaCL, 2M urea, 2M guanidina.
- Contaminación por queratinas: Es esencial trabajar con la mayor limpieza posible, ya que la incorporación de las proteínas contaminantes dificulta o impide la identificación de la proteína de interés. Los contaminantes más frecuentes son la seroalbúmina bovina y las queratinas humanas, estas últimas abundan en el polvo, las huellas dactilares y el cabello. Por esta razón habrá que poner especial énfasis en la limpieza de los cristales que se empleen en la electroforesis y emplear soluciones de tintura frescas. Nunca tocar el gel con los dedos, bisturís o pinzas y cualquier material, que se emplee para recortar las manchas, se debe limpiar.
- Cantidad de la proteína: Cuanto mayor sea la cantidad de la proteína presente en la mancha, más sencillo resultará identificarla. Las proteínas detectables por Coomasie suenen dar espectros MALDI de muy buena calidad, pero un porcentaje muy elevado de las teñidas con plata pueden también ser identificadas inequívocamente. Con el kit de Millipore se obtienen buenos resultados con 100 fmoles de proteína. Se debe tener en cuenta que las proteínas de baja masa molecular (< 20 Kda) pueden resultar difíciles de identificar debido al bajo número de péptidos que origina su digestión enzimática. Para la identificación correcta de las proteínas por Maldi-Tof se requiere que las bandas de las proteínas contengan una única proteína mayoritaria.
- Métodos de tintura: Existen diversos métodos compatibles con la posterior digestión tríptica y el análisis mediante espectrometría de masas. Cuando la cantidad de proteína es suficiente puede emplearse la tintura con Coomasie común o con Coomasie coloidal, pero sí se ve obligado a recurrir a la tintura con plata, emplear un método de tintura con plata compatible con espectrometría de masas que no sea destructiva (que no contenga glutaraldehido).
- Envío de las muestras: Las bandas de las proteínas deberán recortarse del gel adaptándose estrictamente al contorno de las mismas con el fin de no incrementar la proporción de la acrilamida en la muestra. Las dimensiones de la banda no deben exceder de 1x3 mm para 1D y 1-2 mm de diámetro para bandas 2D, ya que tamaños mayores no se adecúan al proceso de la digestión del kit. Para la escisión se puede usar un bisturí y unas pinzas o una punta desechable convenientemente recortada, teniendo siempre cuidado de que dicto material se encuentre completamente limpio. Las bandas así recortadas se deben enviar en tubos eppendorf pequeños cubiertos de agua milli-Q. Para cualquier envío de las muestras, contactar previamente con el responsable de la Unidad en la extensión 16242 o en el e-mail: esteban.guitian [at] usc.es (esteban[dot]guitian[at]usc[dot]es).
Desalado por ZIP-TIP
Proceso de desalado y concentrado de péptidos y proteínas. Para hacerlo se emplean unas puntas de pipeta que contienen una fase reversa bien C18 o C4.